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免疫印跡試驗(western blotting)


    免疫印跡法是一種通過凝膠電泳分離蛋白質并通過電轉移把蛋白質轉移到吸附膜上。一經蛋白印跡后,即可通過特異性的標記抗體檢測到相應蛋白質。
    十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)可用于檢測已被SDS化學變性的蛋白。然而,某些特定的抗體不會在一個變性的蛋白質分子上識別其抗原表位,這時需要進行不含SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
    蛋白印跡轉膜可以通過濕法或半干法進行。在前者,凝膠夾在印跡膜和各種過濾裝置中間,然后把整個裝置埋進一個裝滿Tris轉移緩沖的電極槽中。在后者,夾在中間的凝膠周圍只有少量的緩沖液,然后封閉在電極板之間。雖然半干法轉膜較快,但需要很好地擬合各部分的夾層配件,而濕法轉膜很少會出現問題,可以盡量保持重復實驗結果的一致性。此外,如果半干法轉膜時間過長,較小分子量的蛋白質可能會從膜上轉過。
    轉膜后,需對膜進行封閉,以減少非特異性蛋白結合,然后進行用一抗孵育膜,以研究感興趣的目標蛋白。單克隆抗體通常具有更高的特異性;然而許多單克隆抗體產生于某個特定肽段而不是一個天然蛋白質,因此可能無法檢測到PAGE所分離的天然蛋白。也可使用多克隆抗體,但易形成較高的背景值。因一抗通常無標記,所以需要一個可以結合在一抗Fc段的標記的二抗,以用于最后的檢測。通常會用酶來標記二抗。酶標記后的印跡可通過化學發光酶底物及放射自顯影技術成像。被抗體檢測和標記到的蛋白質會出現在圖像的暗區。
    斑點印跡法類似于免疫印跡法,在膜上檢測目標蛋白;但是斑點印跡法中檢測的蛋白質不用電泳進行分離。取而代之的是,含有目標蛋白的樣品被直接“點”到膜上,這不能做到定量檢測,但它可以直接檢測某種特定蛋白的有無。例如,斑點印跡法可用于檢測蔗糖梯度分離的細胞裂解產物中的某些蛋白質定位。

免疫印跡試驗常見的問題及原因

1、沒有條帶

可能存在的原因

解決方法

抗體不足

抗體與蛋白的親和不高,加大抗體的濃度;抗體活性降低,斑點實驗。

蛋白量不足

增加蛋白的上樣量;其他途徑測定蛋白含量;添加一個陽性對照;斑點實驗

蛋白轉移失敗

PVDF:甲醇激活,NC和PVDF在轉膜液中浸泡;保持膜與膠之間的無氣泡接觸。

蛋白轉移率低

優化轉膜時間,高分子量蛋白可能需要更長的時間,轉膜之后可以用麗春紅染色,并用預染的maker作為指示。

蛋白轉移透膜

降低電壓或者時間當分子量小于10kd時

等電點大于9

使用更高ph值的溶液體系(pH10.5)

二抗使用錯誤

二抗的種屬錯誤

過期的抗體

購買新抗體

抗體的不正確儲存

依據生產商手冊,避免反復凍融

抗體的不正確儲存

避免二抗中含有疊氮鈉,它能催眠HRP信號

一抗結合時間不足

4度過夜孵育

2、微弱的條帶(weak single)

可能存在的原因 解決辦法
蛋白與抗體結合率低

較少洗膜次數或者縮短洗膜時間;

降低洗膜液中NaCl的濃度(0.15M-0.5M);

降低抗體稀釋液中NaCl的濃度(0.15M-0.5M)
抗體量不足 抗體和蛋白的結合較低,可將抗體濃度調整至初始濃度的2-4倍
蛋白量不足 增加蛋白上樣量
酶和底物時效 將酶和底物進行反應,觀察現象,出現異常,則需要重新標記或者購買
過期或者陳舊的ECL發光液 更換的新的ECL發光液
脫脂奶粉可能會掩蓋一些抗原 降低牛奶的百分比或者用BSA代替

3、額外的條帶(Extra Bands)

可能的原因 解決方法
一抗的非特性結合 降低抗體濃度;減少總蛋白的上樣量;免疫親和層析純化抗體
二抗的非特異性結合 跑一個二抗的陰性對照(不孵育一抗);將二抗進行免疫親和層析
一抗或者二抗的非異性結合 添加0.1%-0.5%的吐溫20到抗體稀釋也中;
用2%的脫脂奶粉溶解抗體,并適當調整抗體濃度;增加洗膜液中NaCl的濃度(0.15M-0.5M);增加洗膜時間或者次數;
蛋白聚急 提高DTT的濃度,加樣前加熱煮沸5-10min
蛋白的降解 避免反復凍融;添加蛋白酶抑制劑;制備新鮮樣品;
試劑污染 配置新鮮的給中溶液

4、高背景(High Background)

可能的原因 解決辦法
一抗的非特異性結合 免疫親和層析純化抗體;調整一抗稀釋液中奶粉的百分比和NaCl的濃度;降低抗體濃度
二抗的非特異性結合 跑一個二抗的陰性對照(不孵育一抗);
封閉不充分 用TBST(pH7.5)配制5%的脫脂奶粉,調節其中吐溫20的百分比和其中NaCl的濃度。吐溫的變化范圍0.1%-0.5%;NaCl的濃度范圍是0.15M-0.5M;延長封閉時間
脫脂奶粉可能含有目標抗原 用5%的BSA代替
脫脂奶粉含有內源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈霉親和素不相溶 用5%的BSA代替
某些抗體可能識別牛奶蛋白 用5%的BSA代替
洗膜不充分 增加洗膜次數,提高吐溫20 的百分比
過度曝光 縮短曝光時間

5、 膜上散在不均勻的污點

可能的原因 解決辦法
試劑污染 更換新鮮的試劑
在抗體孵育或洗膜中液體量不夠 確保在抗體孵育和洗膜過程中,液體總量足夠
轉膜有氣泡 再轉膜過程中確保氣泡排干凈
抗體孵育過程中呈現不均勻分布 抗體配制均勻,最好在搖晃的條件下孵育
器具被污染 確保在實驗過程中所有用到器具設備要洗滌干凈
曝光時間過長 縮短曝光時間

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